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    細胞培養細胞培養技術也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對于整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個*的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養，既包括微生物細胞的培養，細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術*的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。通過細胞培養得到大量的細胞或其代謝產物。因為生物產品都是從細胞得來，所以可以說細胞培養技術是生物技術中zui核心、zui基礎的技術。

細胞培養的基本技術

一、清洗

    新采用和重新使用的培養器皿，都要嚴格清洗，以防各種有害物質對培養細胞損害。培養用的塑料器皿目前主要依靠進口，均已無菌密封包裝，可直接使用。對于塑料瓶蓋或膠塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自來水中浸泡和蒸餾水漂洗2～3次，晾干備用。細胞培養中的絕大部分器皿系玻璃制品，清洗過程為以下步驟。

1.  浸泡 新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。

2． 刷洗 浸泡后用軟毛刷和的洗潔精進行刷洗。

3． 酸浸 刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品*浸泡入清潔液中24h。清潔液具有*酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。

4． 沖洗 浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上，不liu任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，烘干備用。要求干凈透明，無油煙，不能殘liu任何有害物質及化學藥品等。

二、消毒

1. 包裝 器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2. 消毒 消毒滅菌隨物品的不同，而采用不同的方法。

（1）紫外線：主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養器皿。進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。

（2）消毒劑：操作者的皮膚、培養瓶的蓋和外壁常用點酒、酒精消毒。無菌室內桌椅和物體的消毒可用0.1％新潔爾滅、過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。實驗室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高錳酸鉀5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一開放容器內，立即可見白色甲醛煙霧，房間密閉24h即可）。

（3）干熱消毒：多用于玻璃器皿消毒，干熱烤箱180℃45～60min。

（4）濕熱消毒：培養液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高壓滅菌10min；布類、玻璃制品、金屬器械等用103kPa（121.3℃）高壓滅菌15～20min。

（5）濾過消毒：用孔徑200～450nm大小的濾板可除去培養液和試劑中的細菌和霉菌等。用200nm孔徑的濾板通過兩次，可使支原體達到某種程度的去除，但不能除去病毒。濾器分為負壓和加壓式兩種。過濾的液體量很少時，可選用注射器微量濾膜濾器。

（6）60Co照射：不耐熱的塑料制品或一次性用品的滅菌可經包裝后，用γ射線照射消毒。

三、無菌操作

    無菌操作是防止污染、決定培養是否成功的首要條件。由于體外培養細胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到zui大限度的無菌。工作前對手部需清洗消毒，進無菌操作室時戴口罩和穿工作服。不能用手直接觸及已消毒器皿內部。打開培養瓶前或封閉瓶口前須火焰燒灼瓶口等。

四、取材

    取材應注意無菌操作，防止污染。污染組織應放入含兩性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、鏈霉素（500μg/ml）的培養液中浸泡10～20min。取材后應立即進行培養。如因故不能培養時，應在無菌條件下，把組織塊切成1cm3大小置于培養液中37℃貯存。存放時間不宜超過24h。

1． 源自人體的腫瘤和其他病理組織的取材、貯存和運送須注意防止污染。

2． 取血：多采用靜脈血，注意無菌操作，如需應用肝素等抗凝劑，也要注意消毒處理。血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液，可采用離心法分離，500～1000r／min，離心5～10min即可。

3． 動物組織：動物皮毛易隱藏微生物，且不易消毒，應特別注意無菌操作。

五、細胞分散法

1． 機械分散 對于腦、胚胎、腫瘤等軟組織，先用組織勻漿器研磨組織，再通過細胞篩獲得單細胞懸液。

2． 胰蛋白酶消化 適合于消化間質較少的軟組織，傳代細胞消化也常采用，是應用較廣泛的消化酶，由于Ca2+ 和Mg2+ 對胰蛋白酶活性有一定抑制作用，因此須用不含這些離子的緩沖液配制。將組織剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍體積的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。

3． 膠原酶消化 對膠原有較強的消化作用，適用消化纖維組織、上皮組織及瘤組織等。膠原酶的使用終濃度為200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用緩和。一般將3～5倍膠原酶溶液加入已剪碎的組織塊中，數小時或10余小時后，可見組織塊逐步變小至幾乎看不見，原來澄清的消化液轉變成混懸液時，可以終止消化，如組織塊較大、細胞量較多時，可于消化期間換消化液一次。消化液經低速離心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培養液，輕輕打散細胞團，制成細胞懸液。

4． EDTA溶液分散 使用濃度為0.02%的EDTA溶液。常用于傳代細胞的消化，作用溫和，毒性小。

六、淋巴細胞分離法

   取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀釋后，沿試管壁慢慢加入4ml淋巴細胞分離液之表面，勿與分離液混合。然后2000r/min水平離心20min，管內分4層，自上而下依次為血漿、單個核細胞（位于細胞分離液上界與血漿下界的中間呈白色霧狀層）、顆粒白細胞（位于淋巴細胞分離液下界與底層紅細胞上界的交界處）和紅細胞（位于管底）。用毛細吸管沿管壁輕輕吸出的淋巴細胞層。然后用Hanks液洗兩次，每次2000r/min離心10min，zui后計數供用。

七、細胞計數

   待測細胞懸液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%臺盼藍0.1ml（死細胞著色）,混合后滴入血球計數板內。于低倍鏡下計數4角的4個大方格內的活細胞（透明未著色）總數,然后用下式計數:

細胞數/每毫升原液=（4大方格內活細胞數/4）×104×稀釋倍數

細胞存活率=（活細胞數/活細胞數+死細胞數）×100％

在計數時遇到對大方格壓線的細胞，應按數上不數下,數左不數右的原則進行計數。